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稳定筛选转染细胞的方法
浏览次数:540发布日期:2021-12-02
  转染细胞稳定筛选的方法是什么呢?
 
  1.确定抗生素作用的浓度:不同的细胞株对各种抗生素有不同的敏感性,因此在筛选前要做预试验,确定抗生素对所选择细胞的作用较低浓度。
 
  ① 提前24 小时在96 孔板或24 孔板中接种细胞8 孔,接种量以第二天长成25%单层为宜,置CO2 孵箱中37℃培养过夜。
 
  ② 将培养液换成含抗生素的培养基, 抗生素浓度按梯度递增0,(50, 100, 200, 400, 600, 800 和1000μ g/ml)。
 
  ③ 培养 10-14 天以绝大部分细胞死亡浓度为准,一般为 400-800μg/ml,筛选稳 定表达克隆时可比该浓度适当提高一个级别维持时使用筛选浓度的一半。
 
  2、转染按前面的步骤进行。
 
  3、转染 72 小时后按 1: 10 的比例将转染细胞在 6 孔板中传代,换为含预试验中 确定的抗生素浓度的选择培养基。在6 孔板内可见单个细胞,继续培养可见单个 细胞分裂繁殖形成单个抗性集落,此时可用两种方法挑选单克隆。
 
  ① 滤纸片法:用消毒的5x5mm 滤纸片浸过胰酶,将滤纸片贴在单细胞集落上10-15 秒,取出粘附有细胞的滤纸片放于 24 孔板中继续加压培养。 细胞在 24 孔板中长满后转入25cm2 培养瓶中,长满后再转入 75cm2 培养瓶中培养。
 
  ② 有限稀释法:将细胞消化下来后做连续的 10 倍稀释(10-2-10-10) ,将每 一稀释度的细胞滴加到 96 孔板中培养,7- 10 天后,选择单个克隆生长的孔再一次进行克隆。
 
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