乙醛酸循环系列_顺乌头酸酶(ACO)测试盒

测定方法：微量法

产品规格：100管/96样

注　意：正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定　

测定意义：

顺乌头酸酶（aconitase），三羧酸循环中的酶，催化柠檬酸转变为异柠檬酸。柠檬酸本身不易氧化，在顺乌头酸酶作用下，通过脱水与加水反应，使羟基由β碳原子转移到α碳原子上，生成易于脱氢氧化的异柠檬酸，为进一步的氧化脱羧反应作准备。

测定原理：

ACO 催化柠檬酸转化成异柠檬酸，异柠檬酸氧化脱羧将 NAD+ 还原生成 NADH，导致 340nm 处光吸收上升。

乙醛酸循环系列_顺乌头酸酶(ACO)测试盒

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制：

试剂一：100mL×1 瓶，-20℃保存；

试剂二：20mL×1 瓶，-20℃保存；

试剂三：1.5mL×1 支，-20℃保存；

试剂四：液体 20mL×1 瓶，4℃保存；

试剂五：液体 5mL×1 瓶，4℃保存；

试剂六：粉剂×1 支，-20℃保存；临用前加 1.5mL 蒸馏水充分溶解；现配现用试剂七：粉剂×1 支，4°保存；临用前加 12mL 试剂四充分溶解；

工作液：临用前在 12mL 试剂七中加入 1mL 蒸馏水、1mL 试剂四、1mL 试剂五、1mL 试剂六充分混匀

样本的前处理：

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：

1、称取约 0.1g 组织或收集 500 万细胞，加入 1mL 试剂一和 10uL 试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

2、将匀浆转入离心管内 600g，4℃离心 5min。

3、弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心 10min。

4、上清液即胞浆提取物，可用于测定胞质顺乌头酸酶活性。

5、在步骤④的沉淀中加入 200uL 试剂二和 2uL 试剂三，超声波破碎（冰浴，功率 20％或200W，超声 3 秒，间隔 10 秒，重复 30 次），用于线粒体顺乌头酸酶活性测定。

测定步骤

1、分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。

2、样本测定

（1）将工作液，置于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴 10min；现配现用；若分次用将工作液分装后于-20°保存，一星期内可用。

（3）在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 40μL 样本 160μL 工作液，混匀，立即记录 340nm

处20s 时的吸光值 A1 和 3min20s 后的吸光值 A2，计算ΔA=A2-A1。 ACO 活性计算