柠檬酸合酶CS测试盒_乙醛酸循环系列_分光法

测定方法：分光光度法

产品规格：50管/24样

注    意：正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做估量定

测定意义：

CS（EC 2.3.3.1）廣泛存在於動物、植物、微生物和培養細胞的線粒體基質中，是三羧酸迴圈第一個限速酶，是三羧酸迴圈主要調控位點之一。

测定原理：

CS催化乙醯CoA和草醯乙酸產生檸檬醯，進一步水解產生檸檬酸；該反應促使無色的DTNB轉變成黃色的TNB，在 412nm處有特徵吸光值。

柠檬酸合酶CS测试盒_乙醛酸循环系列_分光法

自备仪器和用品：

可見分光光度計、臺式離心機、水浴鍋、可調式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽、冰、無水乙醇和蒸餾水

试剂组成和配制：

試劑一：液體50mL×1瓶，-20℃保存；

試劑二：液體10mL×1瓶，-20℃保存；

試劑三：液體1mL×1支，-20℃保存；

試劑四：液體55mL×1瓶，4℃保存；

試劑五：粉劑×1瓶，4℃保存；

試劑六：粉劑×1支，-20℃保存，臨用前加入2.4mL蒸餾水，用不完的試劑仍-20℃保存；

樣本的前處理：

組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

①稱取約0.1g組織或收集500萬細胞，加入1mL試劑一和10uL 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

②將勻漿600g，4℃離心5min。

③棄沉澱，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心10min。

④上清液即胞漿提取物，可用於測定從線粒體洩漏的CS（此步可選做）。

⑤在步驟④的沉澱中加入200uL試劑二和2uL 試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3秒，間隔10秒，重複30次），用於線粒體CS測定。

測定步驟：

1、分光光度計或酶標儀預熱30min以上，調節波長至412nm，蒸餾水調零。

2、樣本測定

（1）在試劑五中加入1.2mL無水乙醇和26mL試劑四，混勻，37℃（哺乳動物）或25℃（其他物種）孵育5min；用不完的試劑分裝後-20℃保存，禁止反復凍融；

（2）測定管：在EP管中加入40μL樣本、880μL試劑五和40μL試劑六，混勻，37℃反應15min後立即測定吸光值A1。

（3）對照管：在EP管中加入40μL樣本、880μL試劑四和40μL試劑六，混勻，37℃反應15min後立即測定吸光值A2。

（4）計算ΔA=A1-A2，每個測定管設一個對照管。