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转氢酶-2测试盒_氧化磷酸化系列

  • 更新时间:  2022-08-01
  • 产品型号:  50管/48样
  • 简单描述
  • 转氢酶-2测试盒_氧化磷酸化系列由上海纪宁生物公司提供,包括转氢酶-2检测试剂盒说明书,免费代测,规格,包装,品牌等关于有关本司测试盒所有产品的详细介绍。
详细介绍

转氢酶-2测试盒_氧化磷酸化系列

测定方法:分光光度法

产品规格:50管/48样

注   意 :正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:

TH位于线粒体的内膜上,又称为线粒体复合体六,催化NADH+NADP+和NAD++NADPH相互转化,调节线粒体NAD(H)和NADP(H)平衡。把逆向反应称为TH-2,催化NADPH和NAD+生成NADP+和NADH。

测定原理:

NADH和NADPH均在340nm有特征吸收,因此TH催化的转氢反应不能导致340nm吸光度发生变化。用人工合成底物3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(APAD+)替代NAD+,TH-2催化APAD+还原生成APADH,APADH在375nm有特征光吸收,测定375nm光吸收的增加速率,来计算TH-2活性。

转氢酶-2测试盒_氧化磷酸化系列

需自备的仪器和用品:

可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制:

试剂一:液体50mL×1瓶,-20℃保存;

试剂二:液体25mL×1瓶,-20℃保存;

试剂三:液体25mL×2瓶,4℃保存;

试剂四:粉剂×2支,-20℃保存;

试剂五:粉剂×2支,-20℃保存;

样本的前处理:

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离:

①准确称取0.1g组织或收集500万细菌或细胞,加入1mL试剂一,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

②将匀浆600g,4℃离心5min。

③弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,11100g,4℃离心10min。

④上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白,可用于测定从线粒体泄漏的TH-2(此步可选做)。

⑤步骤④中的沉淀即为线粒体,加入500uL试剂二,超声波破碎(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10秒,重复30次),用于TH-2活性测定。

测定步骤:

1、分光光度计预热30min以上,调节波长至375nm,蒸馏水调零。

2、样本测定

(1)工作液的配制:临用前取试剂三、试剂四和试剂五各一支,将试剂四、五转移到试剂三中混合溶解,置于37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴5min;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。

(2)在1mL玻璃比色皿中加入100μL样本和1000μL工作液,混匀,立即记录375nm处初始吸光值A1和10min后的吸光值A2,计算ΔA=A2-A1。



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TH-2活性计算:

(1) 按样本蛋白浓度计算

单位的定义:每mg组织蛋白每分钟产生1 nmol APADH定义为一个酶活性单位。

 TH-2活性(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr)÷T=164×ΔA÷Cpr

(2) 按样本鲜重计算

单位的定义:每g组织每分钟产生1 nmol APADH定义为一个酶活性单位。

TH-2活性(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W× V样÷V样总) ÷T=82×ΔA÷W

(3) 按细菌或细胞密度计算

单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟产生1 nmol APADH定义为一个酶活性单位。

TH-2活性(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总) ÷T=0.164×ΔA

V反总:反应体系总体积,1.1×10-3L;ε:APADH摩尔消光系数,6.7×103 L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.1mL;V样总:加入提取液体积,0.5mL;T:反应时间,10 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万。


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