转氢酶-1测试盒 _氧化磷酸化系列

测定方法：分光光度法

产品规格：50管/48样

注   意 ：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

TH位于线粒体的内膜上，又称为呼吸电子传递链复合体六，催化NADH+NADP+和 NAD++NADPH相互转化。催化正向反应称为TH-1。线粒体NADH含量增加时会导致线粒体膜的H+电化学梯度升高，因而促进了电子传递链上ROS的产生。TH-1促进NADH转换为NADPH，从而提高线粒体的抗氧化能力。

转氢酶-1测试盒 _氧化磷酸化系列

测定原理：

NADH和NADPH均在340nm有特征吸收，因此TH催化的转氢反应不能导致340nm吸光度发生变化。用人工合成底物3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸磷酸（APADP+）替代NADP+，TH-1催化 APADP+还原生成的APADPH在375nm有特征光吸收，因此通过测定375nm光吸收增加速率，来计算TH-1活性。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制：

试剂一：液体50mL×1瓶，-20℃保存；

试剂二：液体25mL×1瓶，-20℃保存；

试剂三：液体25mL×2瓶，4℃保存；

试剂四：粉剂×2支，-20℃保存；

试剂五：粉剂×2支，-20℃保存；

样本的前处理：

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：

①准确称取0.1g组织或收集500万细菌或细胞，加入1mL试剂一，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

②将匀浆600g，4℃离心5min。

③弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心10min。

④上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的TH-1（此步可选做）。

⑤步骤④中的沉淀即为线粒体，加入500uL试剂二，超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10秒，重复30次），用于TH-1活性测定。

测定步骤：

1、分光光度计预热30min以上，调节波长至375nm，蒸馏水调零。

2、样本测定

（1）工作液的配制：临用前取试剂三、试剂四和试剂五各一支，将试剂四、五转移到试剂三中混合溶解，置于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴5min；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

（2）在1mL玻璃比色皿中加入100μL样本和1000μL工作液，混匀，立即记录375nm处初始吸光值A1

和 10min后的吸光值A2，计算ΔA=A2-A1。