线粒体呼吸链复合体Ⅴ_氧化磷酸化系列

测定方法：分光光度法

产品规格：25管/12样

注   意 ：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

线粒体复合体Ⅴ又称F1F0-ATP合酶，广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中，由F1和F0两个亚单位组成。该酶利用呼吸链产生的质子电化学梯度催化ATP合成，也可逆过程水解ATP。此外，复合体Ⅴ还存在于叶绿体、异养菌和光合细菌中。复合体Ⅴ是线粒体氧化磷酸化和叶绿体光合磷酸化合成ATP的关键酶。

线粒体呼吸链复合体Ⅴ_氧化磷酸化系列

测定原理：

复合体Ⅴ水解ATP产生ADP和Pi，通过测定Pi增加速率来测定复合体Ⅴ活性。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制：

试剂一：25mL×1瓶，-20℃保存；

试剂二：25mL×1瓶，-20℃保存；

试剂三：1 mL×1瓶，-20℃保存；

试剂四：粉剂×1支，-20℃保存；临用前每支加入1.3mL蒸馏水，充分溶解备用，用不完的试剂仍-20℃保存;

试剂五：6mL×1瓶，4℃保存；

试剂六：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加入3mL蒸馏水，充分混匀；溶解后4℃保存一周；

试剂七：粉剂×1瓶, 4℃保存；临用前加入10mL蒸馏水，充分混匀；溶解后4℃保存一周；

试剂八：粉剂×1瓶, 4℃保存；临用前加入10mL蒸馏水，充分混匀；溶解后4℃保存一周；

试剂九：液体10mL×1 瓶，室温保存。

定磷试剂的配制：按H2O: 试剂七:试剂八:试剂九=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷试剂应为浅。若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染（请根据需要，用多少配多少）。

注意：配试剂好用新的烧杯、玻棒和玻璃移液器，或者一次性塑料器皿，以避免磷污染。

样本的前处理：

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：

①准确称取0.1g组织或收集500万细菌或细胞，加入1mL试剂一和10uL 试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

②将匀浆600g，4℃离心5min。

③弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心10min。

④上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅴ（此步可选做）。

⑤步骤④中的沉淀即为线粒体，加入800uL试剂二和8uL 试剂三，超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，

超声3s，间隔10秒，重复30次），用于复合体Ⅴ酶活性测定。