线粒体呼吸链复合体Ⅳ_氧化磷酸化系列

测定方法：分光光度法

产品规格：25管/24样

注   意 ：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

线粒体复合体Ⅳ又称细胞-色素C氧化酶，也是线粒体呼吸电子传递链主路和支路的共有成分，负责催化还原型细胞-色素C的氧化，并终把电子传递给氧，生成水。

线粒体呼吸链复合体Ⅳ_氧化磷酸化系列

测定原理：

还原型细胞-色素C在550nm有特征光吸收，线粒体复合体Ⅳ催化还原型细胞-色素C生成氧化型细胞-色素C，因此550nm光吸收下降速率能够反映线粒体复合体Ⅳ酶活性。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制：

试剂一：25mL×1瓶，-20℃保存；

试剂二： 5mL×1瓶，-20℃保存；

试剂三：0.5 mL×1瓶，-20℃保存；

试剂四：液体10mL×2瓶，4℃保存；

试剂五：粉剂×2支，-20℃保存；

试剂六：粉剂×2支，-20℃保存；

样本的前处理：

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：

1、准确称取0.1g组织或收集500万细菌或细胞，加入1mL试剂一和10uL 试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

2、将匀浆600g，4℃离心5min。

3、弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心10min。

4、上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅳ（此步可选做）。

5、步骤④中的沉淀即为线粒体，加入200uL试剂二和2uL 试剂三，超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10秒，重复30次），用于复合体Ⅳ酶活性测定。

测定步骤：

1、分光光度计预热30min以上，调节波长至550nm，蒸馏水调零。

2、样本测定

（1）工作液的配制：临用前取试剂四、试剂五、试剂六各一支，将试剂五和试剂六依次转移到试剂四中混合溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

（2）将工作液置于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）孵育5min；

（3）在1mL玻璃比色皿中加入80μL样本和800μL工作液，混匀，记录550nm处初始吸光值A1和 37℃反应30min后的吸光值A2，计算ΔA=A1-A2。

注意点：

1、若ΔA大于0.2，需将样本用试剂二稀释适当倍数（计算公式中乘以相应稀释倍数），使A1-A2小于0.2，可提高检测灵敏度。

2、动物肝脏样本由于酶活性过高， 1分钟内吸光值就会到达平台期，务必先进行2个样本的预测定。可将样本用试剂二稀释10~50倍，反应时间缩到到30秒或1分钟（计算公式中代入实际反应时间，并乘以相应稀释倍数）。其他样本可按照正常测定步骤进行。