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线粒体呼吸链复合体Ⅳ_氧化磷酸化系列

  • 更新时间:  2022-08-01
  • 产品型号:  25管/24样
  • 简单描述
  • 线粒体呼吸链复合体Ⅳ_氧化磷酸化系列由上海纪宁生物公司提供,包括氧化酶测试盒检测试剂盒说明书,免费代测,规格,包装,品牌等关于有关本司测试盒所有产品的详细介绍。
详细介绍

线粒体呼吸链复合体Ⅳ_氧化磷酸化系列

测定方法:分光光度法

产品规格:25管/24样

注   意 :正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:

线粒体复合体Ⅳ又称细胞-色素C氧化酶,也是线粒体呼吸电子传递链主路和支路的共有成分,负责催化还原型细胞-色素C的氧化,并最终把电子传递给氧,生成水。

线粒体呼吸链复合体Ⅳ_氧化磷酸化系列

测定原理:

还原型细胞-色素C在550nm有特征光吸收,线粒体复合体Ⅳ催化还原型细胞-色素C生成氧化型细胞-色素C,因此550nm光吸收下降速率能够反映线粒体复合体Ⅳ酶活性。

需自备的仪器和用品:

可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制:

试剂一:25mL×1瓶,-20℃保存;

试剂二: 5mL×1瓶,-20℃保存;

试剂三:0.5 mL×1瓶,-20℃保存;

试剂四:液体10mL×2瓶,4℃保存;

试剂五:粉剂×2支,-20℃保存;

试剂六:粉剂×2支,-20℃保存;

样本的前处理:

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离:

1、准确称取0.1g组织或收集500万细菌或细胞,加入1mL试剂一和10uL 试剂三,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

2、将匀浆600g,4℃离心5min。

3、弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,11000g,4℃离心10min。

4、上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白,可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅳ(此步可选做)。

5、步骤④中的沉淀即为线粒体,加入200uL试剂二和2uL 试剂三,超声波破碎(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10秒,重复30次),用于复合体Ⅳ酶活性测定。

测定步骤:

1、分光光度计预热30min以上,调节波长至550nm,蒸馏水调零。

2、样本测定

(1)工作液的配制:临用前取试剂四、试剂五、试剂六各一支,将试剂五和试剂六依次转移到试剂四中混合溶解;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。

(2)将工作液置于37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)孵育5min;

(3)在1mL玻璃比色皿中加入80μL样本和800μL工作液,混匀,记录550nm处初始吸光值A1和 37℃反应30min后的吸光值A2,计算ΔA=A1-A2。

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注意点:

1、若ΔA大于0.2,需将样本用试剂二稀释适当倍数(计算公式中乘以相应稀释倍数),使A1-A2小于0.2,可提高检测灵敏度。

2、动物肝脏样本由于酶活性过高, 1分钟内吸光值就会到达平台期,务必先进行2个样本的预测定。可将样本用试剂二稀释10~50倍,反应时间缩到到30秒或1分钟(计算公式中代入实际反应时间,并乘以相应稀释倍数)。其他样本可按照正常测定步骤进行。


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