氧化磷酸化系列_线粒体呼吸链复合体Ⅲ

测定方法：微量法

产品规格：100管/96样

注   意 ：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

线粒体复合体Ⅲ（EC 1.10.2.2）又称CoQ-还原酶，广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中，是线粒体呼吸电子传递链主路和支路的共有成分，负责把还原型CoQ的氢传递。

氧化磷酸化系列_线粒体呼吸链复合体Ⅲ

测定原理：

与氧化型不同，还原型在550nm有特征光吸收，因此550nm光吸收增加速率能够反映线粒体复合体Ⅲ酶活性。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制：

试剂一：液体100mL×1瓶，-20℃保存；

试剂二：液体20mL×1瓶，-20℃保存；

试剂三：液体1.5mL×1支，-20℃保存；

试剂四：液体20mL×1瓶，4℃保存；

试剂五：粉剂×1支，-20℃保存；

试剂六：液体2.5mL×1瓶，-20℃保存；

样本的前处理：

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：

1、准确称取0.1g组织或收集500万细胞，加入1mL试剂一和10uL 试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

2、将匀浆600g，4℃离心5min。

3、弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心10min。

4、上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅲ（此步可选做）。

5、步骤④中的沉淀即为线粒体，加入200uL试剂二和2uL 试剂三，超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10秒，重复30次），用于复合体Ⅲ酶活性测定。

测定步骤：

1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至550nm，蒸馏水调零。

2、样本测定

（1）工作液的配制：将试剂五转移到试剂四中混合溶解，置于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）孵育5min；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

（2）在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL样本、25μL试剂六和200μL工作液，立即混匀，记录

550nm处初始吸光值A1和 2min后的吸光值A2，计算ΔA=A2-A1。