氧化磷酸化系列_线粒体呼吸链复合体Ⅰ
氧化磷酸化系列_线粒体呼吸链复合体Ⅰ
测定方法:微量法
产品规格:100管/96样
注 意 :正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义:
复合体Ⅰ(EC 1.6.5. 3)又称NADH-CoQ 还原酶或NADH脱氢酶,广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中,是线粒体内膜中大的蛋白复合物。该酶催化一对电子从NADH传递给CoQ,同时可使O2还原生成O2.-,是呼吸电子传递链上产生O2.-的主要部位。测定该酶活性,不仅可以反映呼吸电子传递链(ETC)状态,而且可以反映活性氧(ROS)生成状态。
氧化磷酸化系列_线粒体呼吸链复合体Ⅰ
测定原理:
复合体Ⅰ能够催化NADH脱氢生成NAD+,在340nm下测定NADH的氧化速率计算出该酶活性的大小。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制:
试剂一:液体100mL×1瓶,-20℃保存;
试剂二:液体20mL×1瓶,-20℃保存;
试剂三:液体1.5mL×1瓶,-20℃保存;
试剂四:液体25mL×1瓶,-20℃保存;
试剂五:液体1mL×1支,-20℃保存;
试剂六:粉剂×1支,-20℃保存,用时加入2mL蒸馏水;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。
工作液的配制:临用前将试剂五转移到试剂四中混合溶解;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。
样本的前处理:
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离:
①准确称取0.1g组织或收集500万细胞,加入1mL试剂一和10uL 试剂三,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
②将匀浆600g,4℃离心5min。
③弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,11000g,4℃离心10min。
④上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白,可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅰ(此步可选做)。
⑤步骤④中的沉淀即为线粒体,加入200uL试剂二和2uL 试剂三,超声波破碎(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10秒,重复30次),用于复合体Ⅰ酶活性测定。
测定步骤:
1、分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。
2、样本测定
(1)工作液于37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)孵育5min。
(2)在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL样本、200μL工作液和15μL试剂六,混匀,记录340nm处初始吸光值A1和 2min后的吸光值A2,计算ΔA=A1-A2。