线粒体苹果酸脱氢酶MDHm测试盒_三羧酸循环
线粒体苹果酸脱氢酶MDHm测试盒_三羧酸循环
测定方法:分光光度法
产品规格:50管/48样
注 意:正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义:
MDH (EC 1.1.1.37)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,线粒体中MDH是TCA循环的关键酶之一,催化苹果酸形成草酰乙酸;相反,胞浆中MDH催化草酰乙酸形成苹果酸。草酰乙酸是重要的中间产物, 连接多条重要的代谢途径。因此,MDH在细胞多种生理活动中扮演着重要的角色,包括线粒体的能量代谢、 苹果酸-天冬氨酸穿梭系统、活性氧代谢和抗病性等。根据不同的辅酶特异性,MDH分为NAD-依赖的MDH和NADP-依赖的MDH,细菌中通常只含有NAD-MDH,在真核细胞中,NAD-MDH分布于细胞质和线粒体中。
线粒体苹果酸脱氢酶MDHm测试盒_三羧酸循环
测定原理:
MDHm催化NADH还原草酰乙酸生成苹果酸,导致340nm处光吸收下降。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1 mL石英比色皿和蒸馏水。
试剂的组成和配制:
试剂一:液体50mL×1瓶,-20℃保存;
试剂二:液体10mL×1瓶,-20℃保存;
试剂三:液体1mL×1支,-20℃保存;
试剂四、液体50 mL×1瓶,在4℃保存;
试剂五、粉剂×2支,-20℃保存;临用前加入300μL蒸馏水,充分溶解待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。
试剂六、粉剂×2支,-20℃保存;临用前加入300μL蒸馏水,充分溶解待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。
样本测定的准备:
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离:
①称取约0.1g组织或收集500万细胞,加入1mL试剂一和10uL 试剂三,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
②将匀浆液于600g,4℃离心5min。
③弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,11000g,4℃离心10min。
④上清液即胞浆提取物,可用于测定从线粒体泄漏的MDH(此步可选做)。
⑤在步骤④中的沉淀中加入200uL试剂二和2uL 试剂三,超声波破碎(冰浴,功率20%或200W,超声3秒,间隔10秒,重复30次),用于线粒体MDH测定。