线粒体柠檬酸MCA含量测试盒_三羧酸循环系列
线粒体柠檬酸MCA含量测试盒_三羧酸循环系列
测定方法:分光光度法
产品规格:25管/24样
注 意:正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义:
CA是线粒体三羧酸循环的个中间产物,由柠檬酸合酶催化乙酰CoA与草酰乙酸合成,其含量是三羧酸循环强度的主要指标之一。
配合测定丙酮酸含量、丙酮酸脱氢酶活性、乙酰CoA含量、柠檬酸合酶活性和CA含量,其中(1)丙酮酸含量和丙酮酸脱氢酶活性变化可以反映糖酵解进行程度,(2)综合分析丙酮酸含量、丙酮酸脱氢酶活性和乙酰CoA含量变化可以反映脂肪酸β-氧化途径提供的乙酰CoA情况,(3)乙酰CoA含量、柠檬酸合酶活性和CA含量变化可以反映三羧酸循环进行状况。
线粒体柠檬酸MCA含量测试盒_三羧酸循环系列
测定原理:
CA在柠檬酸裂解酶的作用下,生成α-酮酸(草酰乙酸);在弱酸性条件下,α-酮酸进一步与苯肼反应,生成相应的α-酮酸苯腙;α-酮酸苯腙在330nm处有吸收峰,该波长下吸光度的变化程度可反映出CA的含量。
自备仪器和用品:
分光光度计、水浴锅、可调式移液枪、1mL石英比色皿、研钵和蒸馏水。
试剂组成和配制:
酸性提取液:液体25mL×1瓶,4℃保存。
碱性提取液:液体25mL×1瓶,4℃保存。
试剂一:液体7.5mL×1瓶,4℃保存。
试剂二:液体2.5mL×1瓶,4℃保存。
试剂三:粉剂×1瓶,4℃保存;临用前加入7.5mL蒸馏水充分溶解待用;用不完的试剂4℃保存;
标准品:液体1mL×1支,10μmol/mL柠檬酸标准液,4℃保存。
线粒体中柠檬酸提取:
称0.05~0.1g样品(建议称0.1g样本),加入0.5mL酸性提取液,冰上充分研磨,600g/min 4℃离心5min;取上清至另一EP管中,11000g/min 4℃离心10min,弃上清(取300μL该上清液和300μL碱性提取液中和后可用于细胞质CA含量测定);沉淀即线粒体,向沉淀中加入0.5mL酸性提取液,充分悬浮溶解,超声波破碎(功率20%,超声3秒,间隔10秒,重复30次),取此溶液300μL和300μL碱性提取液中和,混匀,置冰上待测(不可用于蛋白质含量测定)。