α酮戊二酸脱氢酶α-KGDH测试盒_三羧酸循环
α酮戊二酸脱氢酶α-KGDH测试盒_三羧酸循环
测定方法:分光光度法
产品规格:500管/48样
注 意:正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义:
α-KGDH(EC 1.2.4.2)广泛存在于动物、植物微生物和培养细胞的线粒体中,是三羧酸循环调控关键酶之一,催化α-酮戊二酸氧化脱羧生成琥珀酰CoA。
α酮戊二酸脱氢酶α-KGDH测试盒_三羧酸循环
测定原理:
α-KGDH催化α-酮戊二酸、NAD+ 和CoA生成琥珀酰CoA、 二氧化碳和 NADH,NADH在340 nm有特征吸收峰,以NADH的生成速率表示α-KGDH活性。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制:
试剂一:50mL×1瓶,-20℃保存;
试剂二:10mL×1瓶,-20℃保存;
试剂三:1mL×1支,-20℃保存;
试剂四:液体55.5mL×1瓶,4℃保存;
试剂五:粉剂×1支,4℃保存;
试剂六:粉剂×1支,4℃保存;
试剂七:粉剂×1支,4℃保存;
试剂八:粉剂×1支,4℃保存;
试剂九:粉剂×1支,-20℃保存;
试剂十:粉剂×1支,-20℃保存;临用前加入2.1mL蒸馏水充分混匀待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。
工作液的配制:临用前把试剂五、试剂六、试剂七、试剂八和试剂九转移到试剂四中混合溶解待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。
样本的前处理:
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离:
1、称取约0.1g组织或收集500万细菌或细胞,加入1mL试剂一和10uL 试剂三,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
2、将匀浆600g,4℃离心5min。
3、弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,11000g,4℃离心10min。
4、上清液即胞浆提取物,可用于测定从线粒体泄漏的α-KGDH(此步可选做)。
5、在步骤④的沉淀中加入200uL试剂二和2uL 试剂三,超声波破碎(冰浴,功率20%或200W,超声3秒,间隔10秒,重复30次),用于线粒体α-KGDH活性测定。