α酮戊二酸脱氢酶α-KGDH测试盒_三羧酸循环

测定方法：分光光度法

产品规格：500管/48样

注    意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

α-KGDH（EC 1.2.4.2）广泛存在于动物、植物微生物和培养细胞的线粒体中，是三羧酸循环调控关键酶之一，催化α-酮戊二酸氧化脱羧生成琥珀酰CoA。

α酮戊二酸脱氢酶α-KGDH测试盒_三羧酸循环

测定原理：

α-KGDH催化α-酮戊二酸、NAD+ 和CoA生成琥珀酰CoA、 二氧化碳和 NADH，NADH在340 nm有特征吸收峰，以NADH的生成速率表示α-KGDH活性。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制：

试剂一：50mL×1瓶，-20℃保存；

试剂二：10mL×1瓶，-20℃保存；

试剂三：1mL×1支，-20℃保存；

试剂四：液体55.5mL×1瓶，4℃保存；

试剂五：粉剂×1支，4℃保存；

试剂六：粉剂×1支，4℃保存；

试剂七：粉剂×1支，4℃保存;

试剂八：粉剂×1支，4℃保存;

试剂九：粉剂×1支，-20℃保存;

试剂十：粉剂×1支，-20℃保存；临用前加入2.1mL蒸馏水充分混匀待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

工作液的配制：临用前把试剂五、试剂六、试剂七、试剂八和试剂九转移到试剂四中混合溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

样本的前处理：

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：

1、称取约0.1g组织或收集500万细菌或细胞，加入1mL试剂一和10uL 试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

2、将匀浆600g，4℃离心5min。

3、弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心10min。

4、上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的α-KGDH（此步可选做）。

5、在步骤④的沉淀中加入200uL试剂二和2uL 试剂三，超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，超声3秒，间隔10秒，重复30次），用于线粒体α-KGDH活性测定。