三羧酸循环_线粒体苹果酸脱氢酶MDHm测试盒

测定方法：微量法

产品规格：100管/96样

注   意 ：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

MDH （EC 1.1.1.37）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，线粒体中MDH是TCA循环的关键酶之一，催化苹果酸形成草酰乙酸；相反，胞浆中MDH催化草酰乙酸形成苹果酸。草酰乙酸是重要的中间产物， 连接多条重要的代谢途径。因此，MDH在细胞多种生理活动中扮演着重要的角色，包括线粒体的能量代谢、 苹果酸-天冬氨酸穿梭系统、活性氧代谢和抗病性等。根据不同的辅酶特异性，MDH分为NAD-依赖的MDH和NADP-依赖的MDH，细菌中通常只含有NAD-MDH，在真核细胞中，NAD-MDH分布于细胞质和线粒体中。

三羧酸循环_线粒体苹果酸脱氢酶MDHm测试盒

测定原理：

MDHm催化NADH还原草酰乙酸生成苹果酸，导致340nm处光吸收下降。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板和蒸馏水。

试剂的组成和配制：

试剂一：100mL×1瓶，-20℃保存；

试剂二：20mL×1瓶，-20℃保存；

试剂三：1.5mL×1支，-20℃保存；

试剂四、液体20 mL×1瓶，在4℃保存；

试剂五、粉剂×1瓶，-20℃保存；

样本测定的准备：

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：

1、称取约0.1g组织或收集500万细胞，加入1mL试剂一和10uL 试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

2、将匀浆液于600g，4℃离心5min。

3、弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心10min。

4、上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的MDH（此步可选做）。

5、在步骤④的沉淀中加入200uL试剂二和2uL 试剂三，超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，超声3秒，间隔10秒，重复30次），用于MDHm活性测定。

测定步骤：

1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

2、检测工作液的配制：用时在试剂五中加入19mL试剂四和0.5mL蒸馏水，充分混匀待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

3、测定前将检测工作液在37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴10min以上。

4、在微量石英比色皿或96孔板中加入5μL样本和195μL工作液，混匀后立即记录340nm处20s时的吸

光值A1和 1min20s后的吸光值A2，计算ΔA=A1-A2。