三羧酸循环_线粒体苹果酸脱氢酶MDHm测试盒
三羧酸循环_线粒体苹果酸脱氢酶MDHm测试盒
测定方法:微量法
产品规格:100管/96样
注 意 :正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义:
MDH (EC 1.1.1.37)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,线粒体中MDH是TCA循环的关键酶之一,催化苹果酸形成草酰乙酸;相反,胞浆中MDH催化草酰乙酸形成苹果酸。草酰乙酸是重要的中间产物, 连接多条重要的代谢途径。因此,MDH在细胞多种生理活动中扮演着重要的角色,包括线粒体的能量代谢、 苹果酸-天冬氨酸穿梭系统、活性氧代谢和抗病性等。根据不同的辅酶特异性,MDH分为NAD-依赖的MDH和NADP-依赖的MDH,细菌中通常只含有NAD-MDH,在真核细胞中,NAD-MDH分布于细胞质和线粒体中。
三羧酸循环_线粒体苹果酸脱氢酶MDHm测试盒
测定原理:
MDHm催化NADH还原草酰乙酸生成苹果酸,导致340nm处光吸收下降。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板和蒸馏水。
试剂的组成和配制:
试剂一:100mL×1瓶,-20℃保存;
试剂二:20mL×1瓶,-20℃保存;
试剂三:1.5mL×1支,-20℃保存;
试剂四、液体20 mL×1瓶,在4℃保存;
试剂五、粉剂×1瓶,-20℃保存;
样本测定的准备:
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离:
1、称取约0.1g组织或收集500万细胞,加入1mL试剂一和10uL 试剂三,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
2、将匀浆液于600g,4℃离心5min。
3、弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,11000g,4℃离心10min。
4、上清液即胞浆提取物,可用于测定从线粒体泄漏的MDH(此步可选做)。
5、在步骤④的沉淀中加入200uL试剂二和2uL 试剂三,超声波破碎(冰浴,功率20%或200W,超声3秒,间隔10秒,重复30次),用于MDHm活性测定。
测定步骤:
1、分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。
2、检测工作液的配制:用时在试剂五中加入19mL试剂四和0.5mL蒸馏水,充分混匀待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。
3、测定前将检测工作液在37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴10min以上。
4、在微量石英比色皿或96孔板中加入5μL样本和195μL工作液,混匀后立即记录340nm处20s时的吸
光值A1和 1min20s后的吸光值A2,计算ΔA=A1-A2。