三羧酸循环系列_柠檬酸(CA)含量测试盒
三羧酸循环系列_柠檬酸(CA)含量测试盒
测定方法:微量法
产品规格:100管/96样
注 意 :正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义:
CA是生物体内常见的有机酸,是重要的食品风味物质。此外,CA是三羧酸循环步反应的产物。
测定原理:
酸性条件下,柠檬酸还原Cr6+生成Cr3+,在545nm处有特征吸收峰;通过测定545nm吸光值的增加,即可计算出样品中柠檬酸含量。
三羧酸循环系列_柠檬酸(CA)含量测试盒
自备仪器和用品:
低温离心机、水浴锅、可调式移液枪、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板和蒸馏水。
试剂组成和配置:
试剂一:液体×1瓶,4℃保存。
试剂二:液体×1瓶,4℃保存。
试剂三:液体×1管,-20℃保存。
试剂四:粉剂×1管,室温保存。临用前配制,加入2mL试剂一,充分溶解。
试剂五:液体×1管,4℃避光保存。
标准品:液体×1管,250μmol/L柠檬酸标准液,4℃保存。
样品中柠檬酸提取:
1.液体样品中柠檬酸提取:取0.1mL液体加试剂一0.9mL,充分混匀,11000g, 4℃离心10min,取上清液,待测。
2.组织中柠檬酸提取:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL试剂一)进行冰浴匀浆。11000g,4℃离心10min,取上清置冰上待测。
3.线粒体中柠檬酸提取:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL试剂一)进行冰浴匀浆,600g/min,4℃离心5min;取上清至另一EP管中,11000g,4℃离心10min,弃上清(此上清液可用于细胞质CA含量测定);向沉淀中加试剂二200μl,以及试剂三2μl,充分悬浮溶解,11000g,4℃离心10min,取上清液,待测。
4.细菌、真菌中:按照细胞数量(104个):试剂一体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细胞加入1mL试剂一),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);11000g,4℃离心10min,取上清置冰上待测。
测定操作:
1. 分光光度计/酶标仪预热30 min,调节波长到545 nm,蒸馏水调零。
2. 试剂一置于30℃水浴中预热30min。
3. 空白管:取0.5 mL EP管,依次加入20μL蒸馏水,140μL试剂一,20μL试剂四,20μL试剂五,混匀后室温静置30min,于545nm测定吸光度,记为A空白管。
4. 标准管:取0.5 mL EP管,依次加入20μL标准液,140μL试剂一,20μL试剂四,20μL试剂五,混匀后室温静置30min,于545nm测定吸光度,记为A标准管。
5. 测定管:取0.5 mL EP管,依次加入20μL上清液,140μL试剂一,20μL试剂四,20μL试剂五,充分混匀后室温静置30min,于545nm测定吸光度,记为A测定管。
注意:空白管和标准管只需测定一次。