丙酮酸激酶(PK)测试盒_糖酵解系列_分光法

测定方法：分光光度法

产品规格：50管/48样

注   意 ：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

PK（EC 2.7.1.40）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，催化糖酵解过程中的后一步反应，是糖酵解过程中的主要限速酶之一，也是产生ATP的关键酶之一，因此测定PK活性具有重要意义。

丙酮酸激酶(PK)测试盒_糖酵解系列_分光法

测定原理：

PK催化磷酸烯醇式丙酮酸和ADP生成ATP和丙酮酸，乳酸脱氢酶进一步催化NADH和丙酮酸生成乳酸和NAD+，在340nm下测定NADH下降速率，即可反映PK活性。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水

试剂的组成和配制：

提取液：60mL×1瓶，4℃保存;

试剂一：液体50mL×1瓶，4℃保存；；

试剂二：粉剂×2瓶，-20℃保存；

试剂三：液体25μL×2支，4℃保存；

样本的前处理：

1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

3、血清（浆）样品：直接检测。

测定步骤：

1、分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

2、样本测定

（1）试剂二的配制：临用前取试剂二一瓶，加入22.5mL试剂一和2.65mL蒸馏水充分溶解，置于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴5min；现配现用。

（2）试剂三的配制：临用前取试剂三一支，加入1.5mL蒸馏水充分溶解待用；现配现用。

（3）在1mL石英比色皿中加入50μL样本、50μL试剂三和900μL试剂二，混匀，立即记录340nm处20s时的吸光值A1和 2min20s后的吸光值A2，计算ΔA=A1-A2。