糖酵解系列_3-磷酸甘油酸激酶PGK测试盒

测定方法：微量法

产品规格：100管/96样

注　意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

3-磷酸甘油酸激酶是糖酵解的关键酶，广泛存在于动植物和微生物体内，催化 1，3-二磷酸甘油酸转变为 3-磷酸甘油酸，产生 1 分子 ATP，具有影响 DNA 复制和修补及刺激病毒 RNA 合成等生物学功能，广泛应用于药物靶标设计。

糖酵解系列_3-磷酸甘油酸激酶PGK测试盒

测定原理：

3-磷酸甘油酸激酶催化 3-磷酸甘油酸和 ATP 产生 1,3-二磷酸甘油酸和 ADP，1,3-二磷酸甘油酸在 3-磷酸甘油醛脱氢酶和 NADH 作用下产生 3-磷酸甘油醛、NAD 和磷酸，340nm 处的吸光度变化反映了 3-磷酸甘油酸激酶的活性的高低。

自备实验用品及仪器：

天平、低温离心机、研钵、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板。

试剂组成和配制：

提取液：液体 100mL×2 瓶，4℃保存。

试剂一：液体 10mL×1 瓶，4℃避光保存。

试剂二：粉剂×1 瓶，-20℃避光保存。临用前加 2mL 蒸馏水充分溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

试剂三：粉剂×1 支，-20℃避光保存。临用前加 1mL 蒸馏水充分溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

试剂四：粉剂×1 支，-20℃避光保存。临用前加 1 mL 蒸馏水充分溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

试剂五：粉剂×1 瓶，-20℃避光保存。临用前加 4 mL 蒸馏水充分溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

酶液提取：

①总 PGK 酶提取：建议称取约 0.1g 样本，加入 1mL 提取液，冰浴匀浆后超声破碎（冰浴，200W，破碎 3s，间歇 7s，总时间 1min），然后 4℃，500g 离心 5min，取上清测定。②胞浆和叶绿体 PGK 酶的分离：按照植物组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5～10 的比例（建议称取约 0.1g 样本，加入 1mL 提取液），冰浴匀浆后于 4℃，500g 离心 5min，弃沉淀，取上清在 4℃，8000g 离心 10min，取上清用于测定胞浆 PGK 酶活性，取沉淀加 1mL 提取液，震荡溶解后超声破碎（冰浴，200W，破碎 3s，间歇 7s，总时间 1min），然后 4℃， 500g 离心 5min，取上清测定叶绿体中 PGK 酶活性。

建议测定总 PGK 酶活性，按照步骤①提取粗酶液，若需要分别测定胞浆和叶绿体中的 PGK，则按照步骤②提取粗酶液。

测定操作：

1.分光光度计/酶标仪预热 30min，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。

2.取微量石英比色皿/96 孔板，依次加入 100μL 试剂一，20μL 试剂二，10μL 试剂三，10μL试剂四，40μL 试剂五，20μL 粗酶液，充分混匀，记录 340nm 处 10s 的吸光值 A1 和 310s的吸光值 A2，△A=A1-A2