糖异生系列_丙酮酸羧化酶(PC)测试盒_微量法

测定方法：微量法

产品规格：100管/96样

注    意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase，PC，EC 6.4.1.1)广泛存在于动物、霉菌和酵母的线粒体中，催化丙酮酸、ATP、CO2和水生成草酰乙酸、ADP和Pi，是糖异生过程的第一个限速酶，在保证血糖的动态平衡方面起着重要的作用。

糖异生系列_丙酮酸羧化酶(PC)测试盒_微量法

测定原理：

PC催化丙酮酸、ATP、CO2和水生成草酰乙酸、ADP和Pi，苹果酸脱氢酶进一步催化草酰乙酸和NADH生成苹果酸和NAD+，在340nm下测定NADH氧化速率，即可反映PC活性。

需自备的仪器和用品：

分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制：

提取液：100mL×1瓶，4℃保存；

试剂一：液体18 mL×1瓶， 4℃保存；

试剂二：液体13uL×1支，4℃保存；

试剂三：粉剂×1支，-20℃保存；

试剂四：粉剂×1支，-20℃保存；

样本的前处理：

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：

1、称取约0.1g组织或收集500万细菌或细胞，加入1mL提取液，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

2、将匀浆600g，4℃离心5min。

3、弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心10min。

4、上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的PC（此步可选做）。

5、在步骤④的沉淀中加入1mL提取液，超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，超声3秒，间隔10秒，重复30次），用于线粒体PC活性测定。

测定步骤：

1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

工作液的配制：临用前将试剂二和试剂三转移到试剂一中混合溶解待用；置于37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)预热5分钟；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

试剂四的配制：在试剂四瓶中加入1mL蒸馏水充分溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

2、在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL样本、10μL试剂四和180μL工作液，立即混匀，记录340nm处初始吸光值A1和 2min后的吸光值A2，计算ΔA=A1-A2。

注意：在该试剂盒中，若ΔA大于0.5，需将样本用提取液稀释适当倍数后测定，使ΔA小于0.5可提高检测灵敏度。计算公式中乘以相应稀释倍数。